固相萃取技术及其在生物样本分析中的应用与进展

　　固相萃取技术是一种发展较快的样本处理技术。微孔滤膜是利用高分子化学材料，致孔添加剂经特殊处理后涂抹在支撑层上制作而成。要用于水系溶液的过滤，故也称水系膜。本文综述该技术的基本原理和方法，近年来填料的改进，操作方法的创新，自动化仪器的发展及其在生物样本分析中的应用。

 　　近20年来，仪器设备分析得到了迅猛发展，尤其是计算机和微处理技术的进步，使分析方法自动化成为可能（maybe)。就生物样本的分析而言，分析过程(guò chéng)包括采样、样本贮存、样本制备、待测物的分离和鉴别以及**后的定量分析。在这一系列过程中，样本制备始终是**为复杂、繁琐却又**为关键（解释:比喻事物的重要组成部分)的一步。因为在此期间，需要对样本进行分离、净化和浓集。目前，**常用的样本制备方法仍是液-液萃取(LLE)的方法。但是，它耗时较长，需要样本的量较大，处理时采用大量有机溶剂(性状：透明，无色的液体)，易形成乳化，造成样本的损失（loss)。与此同时，由于高效液相色谱，特别是反相高效液相色谱的成功应用，使人们利用色谱理论，采用装有不同填料的小柱进行样本制备的固相萃取(亦称液-固萃取)技术(SPE)日益受到重视。该技术于70年代初引入分析中，它大大缩短了样本制备时间，所需样本量少，避免了乳化现象，而且便于自动化操作，真正实现了生物样本分析的高效率。
 　　1  SPE方法
 　　SPE的基本模式  SPE的基本原理是样品在两相之间的分配，即在固相(吸附剂)和液相(溶剂)之间的分配。其保留或洗脱的机制取决于被分析物与吸附剂表面的活性基团，以及被分析物与液相之间的分子间作用力。有两种洗脱模式，一种是被分析物比所存在的生物介质与固相之间的亲和力更强，因而被保留，然后用一种对被分析物亲和力更强的溶剂洗脱;另一种是存在的生物介质较被分析物与固相之间亲和力更强，则被分析物被直接洗脱。通常使用的为前一种模式。
 　　SPE方法  **早的SPE方法是，将含有被分析(Analyse)物的液相倒入盛有适当吸附剂的器皿中，振摇一定时间，使被分析物在两相间分配达平衡，通过过滤或倾泻的方法实现两相的分离。如果吸附剂有效，则大部分被分析物被吸附于固相，然后再用适当的溶剂使之解吸附即可。
 　　现代SPE方法采用长约2~3cm的聚丙烯小柱，内装各种填料，两端装有烧结片或多孔圆片，可通过加压或抽负压的方法使液相经过小柱，实验步骤如下:
 　　**步:使用甲醇润湿小柱，活化填料，以便固相表面易于和被分析物发生分子间相互作用，同时，可以除去填料中可能存在的杂质。李增标等比较了柱的湿润性对多种药物吸附的影响后指出，C18柱在甲醇含量大于8%的水溶液中才能保持湿润而有利于药物的吸附，否则，将导致回收率的降低。
 　　第二步:用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移过多的甲醇，以便样本与固相表面发生作用。但清洗不宜过分，否则会使甲醇含量过低，从而导致湿润度不足，回收率降低。
 　　第三步:加样，使样本经过小柱，弃去废液。
 　　第四步:用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移样本中的内源性杂质和其他相关杂质。
 　　第五步:选择(xuanze)适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂以备后用或直接进行在线分析。
 　　以上的操作步骤（procedure)为分析工作者广泛采用，同时人们正在努力尝试新的技术。为了提高洗脱纯度，缩短溶剂蒸发时间，Liu等将超临界流体萃取技术(SFE)与SPE技术联用，选择ODS柱，操作**第四步后，将填料移**萃取管置于SFE系统的限制器中，然后以CO2-5%甲醇作为超临界流体洗脱分析物，分别采用GC-MS和HPLC分析了狗血浆中痕量的美贝维林醇和黄酮，与SPE方法比较，其回收率略低，但也达到90%左右。
 　　近年来，SPE技术更加趋于微量化，出现了用于SPE的膜片以及固相微萃取技术(SPME)。SPE膜片技术是将吸附剂固定(fixed)在一卷微纤维上，置于SPE膜内，其厚度仅为0.5mm，可允许更高流速通过，对于大量的低浓度样本非常实用，可以实现有效的浓集并房与HPLc系统相联，Kwakman以此对水中有机磷杀虫剂进行了在线检测。SPME技术中的固相为一纤维，可以是熔融石英或覆盖聚二甲基硅氧烷的熔融石英，聚酚亚胺，液晶聚丙烯酸酯，聚乙二醇或石墨。该纤维被置于一个微量注射器的针腔内，使用时将针筒推入，则纤维降低，放大样品液中一段时间，在转子搅拌下，药物被吸附，然后将纤维退回进样针内，当迸样针插入GC进样口时，样品发生热解吸附，从而进入分析柱中。Page等采用SPME-顶空GC分析了食物中的挥发性物质。
 　　2  SPE填料
 　　可应用于SPE的填料种类繁多，其中，吸附型的有:活性炭，硅胶，硅藻土，硅酸镁，氧化铝（Al)等。就化学键合相硅胶而言，正相的有：氨基，腈基，二醇基等；反相的有：C1，C2，C6，C8，C18，腈基，环己基，苯（化学式：C6H6） 基等；离子交换的有：季胺，氨基，二氨基，苯磺酸基，羧基等。此外还有聚合物，如苯乙烯-二乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等。相对于键合相填料，聚合物可适用于全部pH范围，因而用途更广。通常，人们可以根据需要选择填料自行装柱，而众多的商品化小柱为分析的便利及精密提供了可靠的保证。目前，世界上多个公司都生产SPE柱，如AnalytichemInt公司的Bond Elu
　　T、Waters公司的Sep-Pak系列小柱已广泛地用于各种分析工作中;G内也有厂家生产SPE小柱，如河北津杨滤材厂的PT系列。
 　　近年来，HPLC发展的另一热点在于多种新型填料的问世，受其影响，SPE小柱也出现了一些更具选择性的填料。苯基硼酸(phenylboronicacid，PBA)键合硅胶被用于选择性地萃取血浆中的一系列β-拮抗剂，其作用机理在于药物与填料以共价键结合，较为专属地保留该类含醇（chún）羟基的药物。双硫腙或二硫代氨基甲酸盐键合硅胶，其作用机理为离子交换，可选择性地保留重金属。内表面反相吸附剂(internal surface reversed-phase，ISRP)**先用于HPLC，该种填料孔隙的内表面经化学修饰，而外表面不经修饰，处理(chǔ lǐ)血样时无需转移或沉淀蛋白。因为蛋白质等大分子不能渗入孔隙内部，很快被洗脱，而小分子药物则进入孔隙内部被保留。将填料表面经化学修饰后，结合金属离子，形成金属离子覆盖（Cover)相。该种固相通过(tōng guò)药物与金属离子之间形成复合物，从而保留药物。Van der Vlies等利用Fe3+覆盖的8-羟基喹啉键合硅胶，专属地将阿霉素从血浆中萃取出来。环糊精键合的硅胶与药物结合，可形成分子排阻型复合物滞留药物。Agarwd等成功地用β-环糊精键合硅胶萃取了一系列磺胺类药物。此外，免疫亲和色谱(Immunoaffininty Chromatography，IAC)的发展，也使人们采用免疫亲和固相，从事生物样本的纯化，即制备一种专属性的抗体，将其固定在琼脂糖或硅胶上，当样品通过时发生抗原-抗体结合，从而专属性地萃取药物，该方法在生物活性大分子的分离分析(Analyse)中尤为重要。
 　　3  SPE的自动化
 　　在生物样本分析中往往要处理大量的样本，虽然SPE的引入使得单个操作控制较为省时，但大量的重复操作仍是相当耗时的。因此，一段时间内，人们都在设法实现自动化，以使人们从冗长的重复劳动中解脱出来。目前的自动化仪器可分为半自动和全自动两种，半自动SPE是指萃取过程机械化，但将洗脱液转移到进样阀则需手工操作;而全自动SPE则是真正的在线操作，整个的萃取和分析过程都由机器控制完成。
 　　**早的自动化仪器为Du Pont公司的"Prep"系统和Analytichem Int公司的"AASP"。前者属半自动SPE，萃取的操作是在一个转子上依靠离心力完成的;后者属全自动SPE，它采用十通阀，利用切换技术完成全部过程。
 　　如今的半自动SPE，一般都是将样品，小柱，萃取液，废液管及流分收集管置于特定的架子上，使用机械手及注射泵操作。先从各个专门的瓶子或试管中吸取液体，注入相应的小柱中，注射泵加正压，使液体通过小柱。**后，用注射器吸取洗脱液，送入进样口。
 　　全自动的SPE仍是通过(tōng guò)柱切换技术实现的。采用普通的六通阀与HPLC联用，填料一般装于不锈钢小柱中，以适应系统的高压。该小柱处于色谱进样阀中定量管的位置，当进样阀在Load位置，样品被泵入小柱，分析物被保留。同时.流动相由另一泵泵入分析柱。当预浓集过程完成后，进样阀置于Inject位置，流动相通过小柱，将分析物转移**分析柱中。这种系统也可被认为是"预柱"或"双柱"系统，它的缺点是在高压接头状态引入小柱，使得不同样品分析时更换小柱较为困难，因而一次分析完成后需冲洗小柱。现在，可更换柱的商品化仪器也有出现，如荷兰Spark公司的"Prospect"及Merck公司的"OSP-2"系统。
 　　4  SPE在生物样本分析(Analyse)中的应用
 　　SPE技术与LLE技术相比，在生物样本分析方面确有较多优势，因而近年来应用不断增多。在80年代初期，每年该方面的论文极少，而90年代以来，每年都有百篇左右的论文发表。
 　　Okazaki等研究（research)奥弗拉辛及其二甲基和N-氧基代谢物时，比较了SPE和LLE的提取回收率，用LLE法提取时，上述三种物质的回收率分别为39.5%，54.7%和小于5%，而用C8 SPE柱，则所有分析(Analyse)物回收率均达98%。Wientjes等采用LLE提取血浆中2&rsquo；3’-二去氧次黄嘌呤核苷(2&rsquo；3’-dideoxyinosine)时回收率仅33%，而采用C18 SPE柱则获得了90%以上的回收率。
 　　SPE技术萃取的高效性常为分析方法的灵敏度提供可靠的保证。Wells等为了研究布美他尼的药动学，从新生儿体内取得0.2m1血浆及尿样进行分析。在此之前，由于LLE方法需获得较大量的样本，这在临床上对新生儿及婴儿的研究是不可能的，而采用SPE，利用其可以处理微量样本的特性，则获得了成功。Moriyama等应用C18柱萃取，仅用20ml血浆，同时测定了抗癫痫药扑米酮及其活性代谢产物苯乙基丙二酚(phenol)和苯巴比妥。Lu等以SPE-柱后光反应的HPLC荧光检测法测定了血浆中痕量的甲氨喋呤和7-羟基(hydroxyl)甲氨喋呤，其中甲氨喋呤的**低检出限为0.05ng/ml。Stafford等采用二羟基及C18 BondElut小柱处理血浆中抗癌药GI147211的内酯及羧基型成分，**低检出量分别为0.05 ng/ml和0.l ng/ml。Lacroix等建立了SPE-HPLC荧光检测法测定了人血浆中的神经肌阻滞剂米伐库铵(mivacurium chloride)对映异构体及其代谢物，其检测灵敏度可达3.9ng/ml。
 　　Svensson等利用SPE技术的快速、高效性，作为硫利达嗪临床分析的方法，认为该技术用作常规分析大量生物样本十分便利。See等采用Sep-Pak小柱将LTD4拮抗剂MK0476从介质中萃取，以离子色谱法分析了原料药中残留的醋酸盐。Chen等应用ASPEC系统进行了体液中药物的筛选。Muro等以C18小柱萃取尿中的丙戊酸肉碱，随后以GC-MS方法进行测定，从而评价抗惊厥药物丙戊酸的治疗水平。Casas等对体液中一系列的1，4-苯骈二氮杂章类药物进行了研究。Kupferchmidt等研究爱滋病患者血样中3’-迭氮基-3’-去氧胸腺嘧啶脱氧核苷(3’-azido-3’-deoxythymidine)时指出，SPE方法使样本处理**大程度地被精减为实验（experiment)操作控制的安全提供了保障。
 　　SPE由于多采用商品化小柱，价格较为昂贵，但是，由于小柱具有重复使用性，因而，该方法仍有较强的实用价值。溶剂过滤器真空过滤装置主要应用于 高效液相色谱 流动相过滤、粒子物质分析和微生物污染检测。它们是 化学实验室常备器材。Milne等重复使用C18 SPE柱，处理了14次吗啡及其代谢物的血浆样本，精密度仍很满意。Van de Water等使用羧基二咪唑(carbonyldi-imidazole)填料的小柱，重复30次以上，并未发现明显的柱效下降(descend)。
 　　SPE技术的出现使生物样本处理过程(guò chéng)大为简化，自动化SPE的使用真正实现了生物样本的在线分析。微孔滤膜是利用高分子化学材料，致孔添加剂经特殊处理后涂抹在支撑层上制作而成。要用于水系溶液的过滤，故也称水系膜。但是，专属性填料的开发尚处于起步阶段，而自动化仪器设备仍有待于进一步完善，尤其是全自动系统中，如何使小柱更为耐压且易于更换，值得进一步研究。尽管如此，仍然有理由相信SPE技术会逐步成熟，在样本处理技术中处于主要地位。